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新型冠状病毒肺炎为什么强调用核酸检测技术确诊?
发表时间 2020-01-23 17:54
编辑:杨剑锋
阅读量:24
信息来源:省精准医学应用学会

新型冠状病毒肺炎已成为当前公众、社会、政府密切关注的事件。有关研究表明,与2003年非典型肺炎(SARS)类似,本次暴发的肺炎疫情也由冠状病毒引起,此种冠状病毒在1月21日被世界卫生组织正式命名为“2019新型冠状病毒”(2019-nCoV)。


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1 冠状病毒(来自GISAID,全球流感数据共享机构)



根据国家卫生健康委办公厅、国家中医药管理局办公室近日印发《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第三版)》,对于病例的确诊明确:应该在符合疑似病例标准的基础上,采集痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等标本进行实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸,若为阳性则可确诊;或进行病毒基因测序,与已知的新型冠状病毒高度同源。

另外,根据山西省卫生健康委员会办公室发布的《关于做好新型冠状病毒感染肺炎医疗救治工作的通知》(晋卫办医函〔2020〕3号),对于各省首例拟确认的诊断病例,明确要求需在省级疾控中心进行病毒全基因测序,与武汉发生的新型冠状病毒同源的,要立即向国家卫健委报告并申请国家疾控中心进行实验室检测复核,由国家卫健委组织专家进行确认诊断。

由此可见,核酸检测技术在新型冠状病毒肺炎的防控过程中起到了极其重要的作用。其中,全基因组测序技术对本次病原体的确定以及各地疫情的监控等方面起到了基础性的作用,而实时荧光PCR核酸检测技术则为各地疑似案例的快速确诊提供了重要的解决方案。


什么是全基因组测序?


全基因组测序(WGS,whole genome sequencing),是应用新一代测序技术(NGS,next-generation sequencing)对目标基因组进行全序列测定的核酸检测技术应用。NGS技术的特点在于高通量,能一次并行对数百万条DNA分子进行序列读取,同时结合生物信息学的方法,对所测定的序列进行组装拼接或比对。NGS的分辨率达到了单个核酸的级别,能精细地反映所测样本的DNA序列信息。1月10日首个新型冠状病毒(2019-nCoV)的基因组全序列由复旦大学上海市公共卫生临床中心提交至NCBI GenBank数据库,此后陆续有多个不同样本来源的2019-nCoV基因组序列被发布。至此,通过对病毒的全基因组测序,新型冠状病毒的“身份证”——遗传信息被读取,从而为疑似病例的确诊和疫情的监控奠定了数据基础。通过对疑似病例的病毒样本进行全基因组测序,则可通过序列比对准确判断所测样本是否与武汉的新型冠状病毒同源,为有效确诊提供充分的科学证据,因此被应用于各省首例病例的确诊。


全基因组测序的技术原理步骤是:

1、提取目标样本的DNA(脱氧核糖核酸),并制备测序文库。对于以RNA(核糖核酸)为遗传信息载体的新型冠状病毒,则需要先进行培养并提取其RNA,再经过反转录得到对应的DNA。

2、文库DNA在测序芯片或磁珠上进行扩增,最终形成许多簇相同的DNA序列,这是为测序时的信号富集做好准备。

3、通过边合成边测序(Sequences-by-Synthesis)的方法,检测与核酸信息相对应的信号,从而测定有关核酸序列。目前主要有2种平台:一种是基于荧光信号和可逆阻断终止技术,通过检测荧光信号来测定核酸信息;另一种是基于电信号的检测技术,通过检测电信号的强弱来判断所测定的核酸信息。

4、组装。如不考虑参考基因组,则可进行重头组装(denovo assembly),对所测定的序列进行拼接。这次疫情中武汉新型冠状病毒的首个基因组全序列,就是通过此方法完成组装。如考虑参考基因组,则可将所检测到的序列在参照基因组上进行比对,可更快获得所测定样本的全基因组,各省首例的确诊可采用此方式。

 

什么是实时荧光PCR核酸检测?


考虑到时效、成本等问题,全基因组测序并不适用于发热门诊、传染病区和隔离病区中的防治。在这方面,各种体外诊断(IVD,in vitro diagnosis)检测技术能起到简便、快速的作用。其中,实时荧光PCR核酸检测技术就是目前疫情中被采用的主要方法。

据武汉市卫健委1月19日的媒体发布会消息,在不明原因的病毒性肺炎被确定为新型冠状病毒感染所致后,国家相关科研机构迅速研发出病毒核酸检测试剂盒,这有效提高了疑似病例的检验速度。与此同时,我国有多家企业生产出基于荧光PCR的核酸检测试剂。

据界面新闻的报道,国家卫健委已确定三家检测公司为新型冠状肺炎病毒核酸检测试剂盒的供应方,并被多家疾控中心认可与使用。这三家企业分别是上海辉睿生物科技有限公司、上海捷诺生物科技有限公司与上海伯杰医疗科技有限公司。核酸检测试剂的快速开发,为控制疫情发挥了重要作用。


下面说说有关实时荧光PCR核酸检测技术的原理:

首先关于PCR,即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。类似DNA复制,PCR可用于体外扩增特定的DNA片段。


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图2 PCR原理

 

PCR对目标核酸片段的扩增,结合荧光染料的应用,可实现了对目标核酸片段的实时检验测定,即荧光PCR核酸检测。总体有2种方法,一个是基于探针杂交的原理,另一个是基于DNA双链结合的原理。下文以Taqman探针技术,对前者进行简单介绍。

对于Taqman探针的实时荧光PCR核酸检测技术,是对目标病毒核酸片段设计特异结合的荧光探针。当探针结构完整时,存在淬灭基团和报告荧光染料集团。由于两者距离靠近,受淬灭基团影响,报告荧光染料基团发射的荧光信号难以被检测到。在PCR过程中,如果所测样本中存在目标核酸片段(阳性样本),探针便会在引物结合位点下游发生退火,并随着引物的延伸被酶切除,引起报告染料基团和淬灭染料基团进行分离,增强了报告染料基团的信号。每经过一个循环,就会有更多的报告基因染料分子从各自的探针上切断,荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加。通过实时测定荧光信号的上升,可得到有关曲线,从而指示判定目标病毒核酸片段的存在。而如果所测样本中不存在目标核酸片段(阴性样本),探针将难以结合到指定位置,这样实时测定的荧光信号曲线将与阳性样本时不一样。在有了新型冠状病毒的基因组序列后,各技术企业可瞄准该基因组中,既属于本次新型冠状病毒的有关保守区域,又属于能与SARS冠状病毒等区分开的有关多态性区域,从而研发出具备足够灵敏度和特异性的实时荧光PCR核酸检测试剂。


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图3 Taqman探针实时荧光PCR核酸检测原理

 

我们可以看到,在应对引起本次肺炎疫情的新型冠状病毒上,核酸检测技术发挥了应有的技术优势,为病毒的基因组测定、病例诊断和疫情监测提供了可行的解决方案。在疫情暴发后短短1个月即完成病原的确定,继而迅速推出有效的核酸检测方法,这充分说明了我国近年在高通量测序和体外诊断技术自主研发等方面的都取得了创新性的发展。