革兰氏阴性菌外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）是来源于细菌外膜的纳米级结构，近年来被认为在宿主-病原体互作中发挥关键作用。然而，由于其在复杂生物样本中难以识别，OMVs作为生物标志物的潜力仍未被充分挖掘。南方医科大学附属南方医院检验科、广东省精准医学应用学会细胞外囊泡分会主任委员郑磊，南方医科大学附属南方医院检验科、广东省精准医学应用学会细胞外囊泡分会副主任委员司徒博，南方医科大学附属南方医院检验科欧子豪在本研究中提出一种利用多黏菌素B-荧光探针（Polymyxin B-fluorescein，PmBF）检测和定量血液中细菌来源OMVs的新方法。该探针可特异性识别细菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS），从而选择性地标记OMVs，实现其与宿主来源的外泌体的区分，并可通过纳米流式细胞术（nano-flow cytometry）进行定量分析。在雄性小鼠肺炎模型中，研究者发现血清中PmBF阳性外泌体（PmBF⁺ EVs）在感染后6小时即显著升高，早于血液培养结果。在临床样本中，PmBF⁺ EVs在细菌感染的诊断中表现出优越性能，且可有效区分细菌感染与病毒或支原体感染。研究结果表明，循环中的PmBF⁺ EVs有望成为细菌感染的潜在生物标志物。相关研究以Specific labeling of outer membrane vesicles with antibiotic-conjugated probe reveals early bacterial infections in blood发表在Nature Communications上。

研究背景

细菌感染仍是全球范围内导致发病率和死亡率的重要原因，尤其是大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等革兰氏阴性菌，占据了2024年世界卫生组织公布的细菌重点关注病原体名单的大部分。及时且准确的诊断对于优化患者预后和合理使用抗生素至关重要。然而，目前常用的诊断生物标志物仍存在显著局限性。诸如C反应蛋白（CRP）和降钙素原（PCT）等宿主反应标志物往往缺乏针对细菌感染的特异性，且在感染早期或局灶性感染中可能未明显升高。此外，这些标志物在非细菌性感染，如病毒感染、支原体感染以及其他非感染性炎症状态下亦可能升高，进一步限制了其诊断价值。

相比之下，病原体来源的标志物（如细菌抗原和核酸）虽然具有更高的特异性，但在感染早期或细菌负荷较低的情况下敏感性不足。同时，这类标志物也难以准确区分活跃感染与单纯定植。因此，开发更具精准性的诊断标志物迫在眉睫。

革兰氏阴性菌外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）是来源于细菌外膜的纳米级、双层膜结构。这些囊泡在细菌正常生长过程中以及应对环境应激时主动释放，内含多种生物活性成分，包括蛋白质、脂质、核酸和毒力因子。越来越多的研究表明，OMVs在细菌生理调控、致病过程及细胞间通信中发挥重要作用。例如，OMVs可介导水平基因转移，促进生物膜形成，并增强细菌在不利环境下的存活能力。此外，OMVs还通过向宿主细胞递送细菌效应分子、激活先天免疫反应并诱发炎症，调节宿主-病原体互作过程，凸显其在细菌感染发病机制中的潜在作用。已有研究甚至发现OMVs可在细菌感染部位聚集。然而，OMVs与细菌感染的直接关联性及其作为临床生物标志物的应用价值仍有待进一步阐明。

分析宿主生物样本中的OMVs是研究其生物学功能并验证其生物标志物潜力的前提。然而，目前尚缺乏理想的方法。一方面，体液中宿主来源的外泌体数量远多于细菌OMVs，且两者在理化性质上高度相似，极难区分；另一方面，OMVs在体液中含量本就极低，检测分析需具备极高灵敏度。此外，血液中还存在大量粒径相似的杂质成分，尤其是在疾病状态下，如脂蛋白等，会引发干扰信号，影响结果准确性和临床解释。因此，需开发新的工具和策略以突破复杂样本背景对OMVs研究的限制，从而系统解析其在细菌感染中的功能和机制。

为应对上述挑战，研究者在本研究中开发了一种基于抗生素-荧光探针（Polymyxin B-FITC，PmBF）的新型方法，能够在复杂生物样本中高特异性、高灵敏度地检测和定量细菌来源的OMVs。利用该策略，研究者在细菌感染早期即观察到循环系统中存在细菌OMVs，其检出阳性率高于常规血培养，提示其作为细菌感染早期生物标志物的潜在价值。本研究成果不仅为宿主-病原体互作机制的深入理解提供了新视角，也为细菌感染的早期精准诊断提供了新的解决路径（见Fig. 1）。

实验结果1

PmBF可特异性识别并定量检测细菌OMVs

实现OMVs与宿主来源外泌体（EVs）之间的准确区分是精确分析OMVs的前提。为应对这一挑战，研究者尝试筛选一种能高度特异识别细菌结构的分子。由于抗生素在识别微生物细胞方面具有高度特异性，研究者认为其为理想候选。通过初步文献调研，研究者确定多黏菌素B（Polymyxin B，PmB）为最具潜力的分子。PmB是一种由Paenibacillus polymyxa分泌的环状阳离子多肽抗生素，可通过结合革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）发挥抗菌作用。基于该特性，研究者在其N端接入异硫氰酸荧光素（FITC），合成荧光探针PmB-FITC（PmBF）。

经MALDI-TOF质谱分析（Supplementary Figs. 1a–c）证实PmB与FITC成功偶联，荧光检测及吸收光谱分析（Supplementary Fig. 1d）表明FITC标记后的PmBF仍保持良好荧光性能。随后，研究者对PmBF的杀菌活性进行了评估，结果显示其抗菌能力相较原始PmB有所降低（Supplementary Fig. 1e），可能因FITC修饰引起PmB构象变化，影响其插入细菌膜的能力。

为验证PmBF的靶向特异性，研究者将其分别与革兰氏阴性菌E. coli、革兰氏阳性菌S. aureus和哺乳动物细胞HeLa共孵育。超分辨成像（Fig. 2a）和共聚焦图像（Supplementary Fig. 2）显示，PmBF信号仅与E. coli共定位，而在S. aureus与HeLa中未见明显信号。荧光强度定量分析（Fig. 2b）进一步验证了PmBF对E. coli的特异性识别能力。

为了明确PmBF是通过识别LPS实现靶向，研究者使用LPS特异性抗体对E. coli进行预处理以阻断LPS，随后进行PmBF标记。荧光成像结果（Supplementary Fig. 3）显示阻断后荧光显著减弱，证实PmBF结合E. coli依赖于其与LPS的特异性相互作用，也表明其可用于识别同样含LPS的OMVs。

研究者进一步探讨了PmBF对OMVs的识别能力。通过超速离心法分别从E. coli、S. aureus和HeLa培养液中提取EVs，并采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、蛋白免疫印迹（WB）和透射电子显微镜（TEM）进行表征。NTA数据显示，三类EV的平均粒径分别为94.7 nm、112.4 nm和103.5 nm（Fig. 2c，Supplementary Figs. 4a, b）；WB检测发现，E. coli来源OMVs表达OmpA与LPS，S. aureus EVs表达LTA，HeLa EVs表达TSG101与CD81（Fig. 2d，Supplementary Figs. 4c, d，Supplementary Fig. 12）；TEM图像显示EVs均呈典型球形结构（Fig. 2e，Supplementary Figs. 4c, d），表明EVs成功提取。

为评估PmBF与OMVs的结合能力，研究者使用CellMask™ Deep Red预染EVs膜结构后与PmBF共孵育，并进行超分辨成像。结果显示，PmBF信号与E. coli OMVs共定位明显，而在S. aureus与HeLa EVs中无明显信号（Fig. 2f，Supplementary Fig. 4e），证实PmBF可特异性识别E. coli来源OMVs。

为实现对PmBF标记OMVs的定量分析，研究者引入了纳米流式细胞术（nano-flow cytometry，Fig. 2g），可用于分析粒径在40–1000 nm范围内的颗粒。该平台能有效区分EVs与膜碎片等杂质，后者是潜在的假阳性来源。研究者使用Triton X-100处理E. coli OMVs，获得囊泡碎片样品，检测结果显示其信号显著低于天然OMVs，粒子数量减少约7.78倍（Fig. 2h, i），说明该平台具备良好抗杂质干扰能力，适用于OMVs定量检测。

目前已知OMVs广泛存在于人体体液中，并参与多种生物学过程，但关于其在体液中的浓度数据仍较有限。以往研究多采用ELISA、WB或LAL法检测OMVs中LPS含量，无法直接反映颗粒浓度。研究者前期研究发现，健康成人血清中OMVs约占EVs总量的3–4%，约为3 × 10⁷至4 × 10¹⁰颗粒/mL；革兰氏阴性菌培养上清中OMVs浓度约为3.26 × 10¹²颗粒/mL。在本研究中，纳米流式平台最低可检测浓度为2 × 10⁵颗粒/mL（Fig. 2j），而WB仅在OMVs浓度超过2 × 10⁹颗粒/mL时出现条带（Supplementary Fig. 5a），显示该平台具备高灵敏度，适用于OMVs检测。

为优化PmBF标记浓度，研究者设定不同浓度对E. coli OMVs进行标记（Supplementary Fig. 5b），结果显示，当PmBF浓度高于5 μM时，阳性标记率趋于稳定。综合考虑标记效率与非特异结合，研究者最终选定5 μM作为后续实验的标准使用浓度。

随后，研究者拓展检测对象，包括哺乳动物细胞、革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌来源的EVs，均进行PmBF标记后使用纳米流式检测（Fig. 2k）。结果显示，OMVs的标记效率显著高于其他EVs：E. coli（37.53%）、K. pneumoniae（40.50%）、A. baumannii（39.73%）；而HeLa（3.07%）、S. aureus（2.93%）与S. epidermidis（3.07%）较低，可能源于非特异吸附。这进一步确认PmBF结合OMVs具备良好特异性，且可实现定量分析。

为进一步验证PmBF的特异性，研究者考察其在血脂类干扰背景下的识别能力。结果显示，与LPS抗体检测相比，PmBF与阴性对照组（VLDL液）标记率相近，均显著低于LPS抗体组（Fig. 2l），提示PmBF对脂蛋白等非特异性干扰具较强抵抗力。

最后，研究者将E. coli OMVs与HeLa或S. aureus EVs按不同比例混合，构建6种模型（HeLa组、S. aureus组、EHS组、EH组、ES组、E. coli组），检测各组中OMVs的标记情况（Fig. 2m）。结果显示，不论OMVs比例如何变化，该方法均能准确反映OMVs相对比例，回收率稳定，进一步验证了该方法在混合EV样本中具有良好的灵敏度与特异性，证实PmBF具备高效识别OMVs的能力，且能抵抗脂蛋白与其他EVs干扰。

实验结果2

PmBF标记过程保留了OMVs的完整性与生物活性

在标记过程中维持OMVs的物理、化学及功能完整性，是可靠研究其在多种生理与病理过程中的作用的基础。为验证PmBF在OMVs研究中的适用性，研究者对其生物相容性进行了系统评估，重点考察其对OMVs天然性质与功能的保持能力。

首先，研究者评估了标记过程是否影响OMVs的基本特性，包括粒径、浓度和形貌。NTA和TEM结果显示，PmBF标记不会改变OMVs的粒径分布及球形形貌（Supplementary Fig. 6a–c），推测与PmBF分子量较小有关，可在不引发显著结构扰动的情况下实现高效标记。此外，研究者评估了PmBF-OMVs在贮存过程中的稳定性。结果表明，PmBF-OMVs在4°C条件下贮存7天后，粒径与浓度未出现明显变化，与未标记OMVs相当（Supplementary Fig. 6d, e），提示标记过程未破坏OMVs的物理结构。进一步地，研究者检测了PmBF标记的荧光稳定性，在7天内荧光强度波动极小（Supplementary Fig. 6f），表明PmBF具备良好的标记稳定性。

在蛋白质组层面，Western blot分析显示，PmBF标记不会改变OMVs的蛋白质组成（Supplementary Figs. 6g 和 12）。考虑到PmB主要通过与革兰氏阴性菌LPS的负电荷区域结合发挥作用，研究者进一步检测了标记前后OMVs的zeta电位。结果显示，PmBF标记不会显著改变OMVs的zeta电位（Supplementary Fig. 7a）。进一步地，在细菌水平上进行相同检测，也未观察到PmBF在标记浓度下对细菌zeta电位的显著影响（Supplementary Fig. 7b）。为排除FITC标记对上述现象的潜在影响，研究者使用不同浓度的PmB与PmBF处理E. coli，结果显示，无论浓度如何变化，均未显著影响细菌浓度（Supplementary Fig. 7c），进一步证实PmBF探针在实验条件下对OMVs及细菌的结构完整性影响甚微。

在生物活性方面，研究者评估了OMVs对BEAS-2B细胞增殖的影响。结果显示，自然OMVs与PmBF-OMVs在共孵育12 h与24 h后对细胞增殖的作用相当（Supplementary Fig. 7d）。为进一步观察标记是否影响OMVs与细胞的相互作用，研究者使用CellMask™ Deep Red膜染料分别对自然OMVs与PmBF-OMVs进行染色，并观察其细胞摄取情况。结果显示，两者在3 h与24 h后均被细胞成功摄取，荧光图像（Fig. 3a，Supplementary Fig. 7e）及定量荧光分析均显示无显著差异，提示标记不影响细胞摄取效率。

进一步地，研究者考察了PMBF标记是否影响OMVs的细胞内分布。分别对细胞内不同胞器进行染色并与摄取后的OMVs进行共定位分析（Fig. 3b，Supplementary Fig. 7f），结果发现OMVs主要定位于溶酶体区域，且PmBF-OMVs与自然OMVs的分布模式一致。尽管当前实验条件尚无法精准解析PmBF标记对具体摄取通路的影响，但总体内吞水平未受显著影响，提示包括受体介导的内吞在内的主要内吞机制未被实质性抑制。

此外，为进一步评估PmBF标记对OMVs生物学功能的影响，研究者采用创伤愈合划痕实验对其调控细胞迁移能力进行评估。此前已有研究表明OMVs可调节细胞迁移，且该实验可提供简洁量化的功能性评价指标。结果显示，在所有检测浓度下，PmBF-OMVs与自然OMVs对BEAS-2B细胞迁移速率的影响无显著差异（Fig. 3c），提示PmBF标记不会损害OMVs的迁移调控能力。

综上结果，研究者系统地验证了PmBF标记过程在物理结构、生物组成、细胞摄取及生物功能等多个层面均具良好稳定性与非干扰性，进一步确认该探针在OMVs功能研究及生物标志物开发中的广泛适用性。

实验结果3

循环OMVs可作为细菌感染的早期标志物

已有研究证实，小比例的细菌来源OMVs可存在于小鼠和人类的血清中。为验证本研究开发的基于抗生素的荧光探针是否能够检测血清中的OMVs，研究者选择无菌（GF，无任何细菌定植）雄性小鼠与特定病原体阴性（SPF，具有正常肠道菌群）雄性小鼠作为模型。理论上，GF小鼠体内不存在细菌，因此可作为背景对照。检测结果显示，SPF小鼠血清中平均4.80%的EVs为PmBF阳性，而GF小鼠中该比例为1.97%，差异显著（Fig. 4a）。为进一步验证该差异是否源于小鼠体内细菌的存在，研究者给予小鼠广谱抗生素以清除体内细菌（Fig. 4b），粪便菌落计数显著下降（Supplementary Fig. 8a），表明抗生素处理有效。处理后的小鼠血清中PmBF阳性EV比例下降至2.03%（Fig. 4c），接近GF小鼠水平。这些结果表明该探针可有效识别血清中细菌来源OMVs，且其存在与体内细菌负荷密切相关。

进一步地，研究者在细菌感染模型中验证了该相关性。通过鼻内滴注大肠杆菌（E. coli）或肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）建立雄性小鼠肺部感染模型（Fig. 4d），并在感染后的多个时间点收集血液样本进行细菌培养及血清EVs检测。在E. coli感染组中，血清中PmBF⁺ EVs的水平在感染后6、12、24小时均显著升高（Figs. 4e, f），而细菌培养在6小时时仅有1只小鼠阳性。各时间点的PmBF⁺ EV阳性率均高于血液培养（Fig. 4g）。常用炎症标志物CRP和PCT则表现出不一致的变化趋势（Supplementary Figs. 8b, c），其中PCT在6、12、24小时无显著升高，CRP在12小时时亦未显著升高。类似地，在K. pneumoniae感染模型中，PmBF⁺ EVs在感染后6、12、24小时均呈升高趋势，而血液细菌培养均为阴性（Supplementary Figs. 8d–f）。为评估PmBF对革兰氏阴性细菌感染的特异性，研究者建立了由革兰氏阳性细菌肺炎链球菌（S. pneumoniae）引发的感染模型，在感染12小时后检测血清EVs，结果显示PmBF⁺ EVs水平并未变化（Supplementary Fig. 8g），进一步支持了PmBF在识别革兰氏阴性菌感染中的特异性。

为探究不同细菌负荷对循环OMVs水平的影响，研究者以不同浓度细菌感染小鼠，检测其血清OMVs含量。结果发现，当细菌负荷达到8 × 10⁶ CFU时，部分小鼠循环OMVs水平开始出现平台期；而在8 × 10⁵ CFU以下时，其水平与未感染对照组相近（Supplementary Fig. 8h）。

为明确血液中升高的PmBF⁺ EVs是否来自感染部位的细菌，而非由于肠道屏障损伤导致的OMVs泄漏，研究者构建了表达mCherry-OmpA融合蛋白的大肠杆菌菌株。相比野生型，mCherry标记菌株具有更强的红色荧光信号（Supplementary Fig. 9）。进一步实验表明，该菌株分泌的OMVs中可检测到mCherry信号（Fig. 4h）。在肺部感染模型中，经鼻注入mCherry-E. coli后，在感染6小时血清中可检测到平均8.2%的mCherry⁺囊泡，显著高于PBS处理组（Fig. 4i），而血液培养中未检出可存活的mCherry菌株（Fig. 4j）。这些结果证实循环中升高的PmBF⁺ OMVs主要来源于感染部位的致病菌，支持其作为敏感感染标志物的潜力。

为进一步验证循环OMVs水平能否反映感染动态变化及治疗应答，研究者对感染小鼠进行抗生素干预，并动态监测OMVs水平变化。结果显示，感染后6小时血清OMVs开始升高，12小时达到峰值，提示活跃感染状态；随后给予抗生素治疗，OMVs水平逐渐下降，至36–48小时回落至正常水平（Fig. 4k）。这一趋势说明循环OMVs水平可动态反映感染进程及治疗效果，具有潜力作为疗效评估的生物标志物。

此外，为验证早期诊断在治疗中的重要性，研究者设定不同时间点开始抗生素干预，并每12小时给予一次，记录生存率（Fig. 4l）。结果显示，延迟治疗组在32小时生存率下降至30.8%，而早期治疗组生存率提升至76.9%（Fig. 4m），表明早期干预对预后具有显著改善作用。值得注意的是，在该肺部感染模型中，PmBF⁺ EVs可在感染后6小时即被检测到，早于血液细菌培养阳性和炎症指标显著升高的时间点。这一发现强调了PmBF⁺ EVs在早期诊断和治疗决策中的潜在价值，有望显著改善感染性疾病的临床结局。

实验结果4

PmBF⁺ EVs作为细菌感染生物标志物的临床应用价值

为评估PmBF⁺ EVs作为细菌感染生物标志物的临床潜力，研究者分析了来自健康人群与细菌感染患者的血清样本，其中细菌感染患者包括血流培养阴性（BI）与阳性（BSI）两类（Fig. 5a，Supplementary Table 1）。血清EVs经纳米颗粒跟踪分析（NTA）、蛋白免疫印迹（WB）和透射电镜（TEM）进行表征（Supplementary Figs. 10 和 12）。如Fig. 5b所示，细菌感染患者血清中PmBF⁺ EVs水平较健康对照显著升高（平均7.90% vs. 4.00%），且BSI患者水平（平均9.61%，范围5.00–15.90%）高于BI患者（平均6.75%，范围0.70–16.50%），提示PmBF⁺ EVs水平与感染严重程度之间可能存在关联。

为进一步评估PmBF⁺ EVs的诊断效能，研究者进行了受试者工作特征曲线（ROC）分析。结果显示，对于所有细菌感染及血流感染患者，PmBF⁺ EVs的曲线下面积（AUC）分别为0.817与0.974（Fig. 5c, e）。值得注意的是，将PmBF⁺ EVs与PCT及CRP联合使用可进一步提升诊断AUC值，尤其在血流感染诊断中表现更加突出（Fig. 5d, f）。

此外，研究者还探讨了PmBF⁺ EVs在细菌感染与病毒或支原体感染的鉴别诊断中的潜力（Fig. 5g，Supplementary Table 1）。结果表明，细菌感染患者血清中循环PmBF⁺ EVs水平显著高于病毒或支原体感染者（Fig. 5h）。ROC分析结果显示，PmBF⁺ EVs在细菌感染与病毒感染之间的AUC为0.817，在细菌感染与支原体感染之间的AUC为0.840（Fig. 5i, k）。进一步将PmBF⁺ EVs与PCT和CRP联合分析后，AUC分别提升至0.949和0.959，显示出其在细菌感染鉴别诊断中的显著应用潜力。

综上，研究者结果表明PmBF⁺ EVs可作为反映感染程度、支持早期诊断及与其他感染性疾病进行鉴别的有效生物标志物，在临床感染管理中具有重要价值。

总结

总而言之，研究者开发出一种可用于复杂生物样本中特异性检测与定量OMVs的新策略。该方法结合了基于多黏菌素B（PmB）的荧光探针与先进的纳米颗粒分析技术，成功揭示了在动物模型和人类患者血液样本中存在OMVs，表明其在细菌感染早期具有潜在的生物标志物价值。研究结果发现，在感染初期循环中的PmBF⁺ EVs水平显著升高，早于传统诊断标志物的变化。

具有重要临床意义的是，研究者进一步证实循环中的PmBF⁺ EVs可作为细菌感染早期诊断与鉴别诊断的有力生物标志物。因此，该检测方法不仅为深入理解细菌感染提供了有效平台，也有望在临床实践中提升感染性疾病的诊断与管理水平。

来源：生物纳米研究