癌症组织中常见免疫细胞浸润,其与肿瘤细胞、间质细胞等共同构成肿瘤微环境(TME)。三级淋巴结构(TLS)是免疫细胞在炎症、感染或肿瘤组织中形成的有序异位区域结构。以往研究发现了构成肿瘤TLS的主要细胞种类,包括T细胞、B细胞、抗原呈递细胞(APCs)、支持性的间质细胞和滤泡树突状细胞(FDC)。近期,利用单细胞和空间转录组学在卵巢癌、头颈鳞癌、肾癌等研究进一步揭示了TLS中存在包括CXCL13+ T辅助细胞、SEMA4A+生发中心B细胞和CXCL12+成纤维细胞等关键细胞亚群。这些结果说明TLS组成复杂并存在广泛的异质性。已有研究证实,TLS及其组分在抑制肿瘤进展和促进免疫治疗反应中发挥重要作用,但TLS如何形成及其发挥作用机制尚未清楚。
2024年9月4日,广东省精准医学应用学会单细胞科技分会主任委员、中山大学肿瘤防治中心贝锦新教授及其团队在《Nature Communications》发表了题为《Single-Cell and Spatial Transcriptome Analyses Reveal Tertiary Lymphoid Structures Linked to Tumour Progression and Immunotherapy Response in Nasopharyngeal Carcinoma》的研究论文。该研究以鼻咽癌(NPC)为模型,首次系统解析了单细胞和空间水平上肿瘤内TLS的细胞组成及抗肿瘤作用机制,为肿瘤患者免疫治疗提供了新的靶点,为预测肿瘤免疫治疗疗效提供有效工具。
NPC肿瘤微环境以EB病毒(EBV)感染肿瘤细胞和大量免疫细胞的浸润为主要特点。该团队针对NPC不同分期、免疫检查点抑制剂治疗响应差异等临床现象,利用10x Genomics 5' 单细胞转录组、免疫组库(VDJ)测序以及Stereo-seq和Visium空间单细胞转录组测序等技术,解析NPC肿瘤组织内TLS的细胞组成,详细刻画了肿瘤进展、免疫治疗响应相关的肿瘤TLS组成变化,解析了其抗肿瘤作用机制,并且通过细胞共培养实验、生存分析、多重免疫组化和相关公共转录组数据集等方法验证了重要的发现(图1)。
图1. 整体研究设计
研究人员首先利用单细胞转录组测序技术鉴定了NPC肿瘤组织中五个具有典型TLS标记物的细胞亚群,包括生发中心(GC)B细胞(CD19, MS4A1, RGS13, AICDA, BCL6;明区和暗区)、CD4+CXCR5+ T滤泡辅助细胞(CD4, CXCR5, CXCL13, BCL6)、CXCL13+CD8+ T细胞(CD8A, CXCR5, CXCL13, BCL6)以及CXCL13+肿瘤相关成纤维(CAFs)细胞(COL1A1, CXCL13, CCL19, CCL21),进一步利用Stereo-seq和Visium空间转录组测序技术验证了上述细胞亚群空间位于TLS内。
针对TLS中GC B细胞的关键角色,研究人员通过拟时序分化轨迹分析揭示了幼稚B细胞向记忆B细胞、GC B细胞和浆细胞的分化过程。研究发现,生发中心反应所生成的浆细胞可能是抗肿瘤抗体的重要来源。然而,通过一系列生物信息学分析,研究人员观察到,相较于早期NPC,在晚期NPC中GC B细胞与浆细胞之间的相同BCR克隆型转换减少,浆细胞所产生的IgA和IgG抗体水平显著较低;并且,低GC B细胞比例和抗体水平与患者不良预后相关。这些结果表明,随着肿瘤进展,经历生发中心反应的浆细胞抗体产生减少,进而不利于NPC患者的预后。进一步研究表明,NPC中的浆细胞与NK细胞和巨噬细胞紧密共定位,可能通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC;NK细胞)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP;巨噬细胞)作用促进肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤效应。研究还发现,NPC内浆细胞的数量与高表达EBV相关分子的恶性细胞亚群(具有更强免疫抑制功能)呈负相关。通过定量分析空间转录组和多重免疫组化数据,研究人员发现浆细胞分泌的抗体通过ADCC和ADCP机制促进了高表达EBV相关分子恶性细胞的凋亡。这一过程对解除NPC的免疫抑制微环境以及改善NPC患者对免疫治疗的响应具有重要意义。此外,研究还定义了肿瘤细胞聚集区域(TCA),根据其中EBV相关分子和浆细胞分布,能够将NPC肿瘤分为四类,发现TCA表达高水平EBV相关分子和具有较多浆细胞浸润的亚型(EBVhigh-TCA-wP)预后最好(图2)。
该研究发现TLS相关CXCL13+CAFs通过CXCL13-CXCR5、VCAM1-整合素、ICAM1-整合素等配体-受体对与B细胞进行相互作用,并通过ST分析、多重免疫组化分析及体外细胞共培养实验进一步证实了CXCL13+CAFs促进B细胞趋化、粘附以及分化和成熟。这些发现表明CXCL13+CAFs在促进NPC患者免疫应答和改善预后中扮演了重要角色。
研究者还发现TLS相关的CXCL13+CD8+ T细胞在识别和攻击肿瘤细胞中可能发挥关键作用。此外,研究还发现CXCL13+CD8+ T细胞在早期肿瘤中的比例显著高于晚期肿瘤,凸显了它们在肿瘤早期阶段发挥抗肿瘤潜力。这些发现表明在晚期肿瘤中增加CXCL13+CD8+ T细胞含量可能有助于提高抗肿瘤治疗效果,为治疗晚期肿瘤提了供新的策略。
最后,在NPC中与肿瘤TLS相关的细胞亚群通过配体-受体相互作用形成了一个免疫活化微环境,这与患者的预后密切相关。生存分析显示,具有高TLS细胞标志(TLS-CS)的患者比低TLS-CS的患者呈现显著更好的预后。此外,多重免疫组化染色验证了含有TLS的样本中免疫细胞浸润程度更高,与患者更好的预后关联,强调了TLS作为预后指标的独立作用。这些研究结果表明,TLS中的关键细胞亚群不仅在NPC的肿瘤微环境中创建了一个免疫活化的区域,而且显著影响患者的预后和对免疫治疗的响应。这些发现再次强调了维持或增强这种免疫微环境的潜在治疗价值。
总之,该研究首次利用高发于我国的EBV感染相关鼻咽癌,在单细胞和空间水平高分辨率上解析了肿瘤TLS细胞组成异质性,鉴定了构成TLS结构的重要细胞亚群及分子特征,阐明了TLS抑制肿瘤进展和促进免疫治疗反应的机制(图2),为基于TLS的肿瘤分子分型和免疫治疗提供了新的策略。
图2. 鼻咽癌免疫治疗响应及非响应患者肿瘤组织细胞组分示意图
中山大学肿瘤防治中心刘洋博士、何帅副研究员、迟冬梅主治医生和王秀芝博士后、中山大学附属第八医院叶双燕博士为本文的共同第一作者,中山大学肿瘤防治中心贝锦新教授为通讯作者。相关研究成果已申请专利,将进一步推动成果临床转化应用,保障人民健康。
该研究获得国家自然科学基金与澳门科学技术发展基金(FDCT-NSFC;82261160657)、国家重点研发计划(NKRDPC;2022YFC3400901)、国家自然科学基金(82130078)、广州市科技计划项目基金(201707020039)、广东省创新创业团队计划(2016ZT06S638)、长江学者计划(J.-X.B.),以及香港研究资助局(RGC)主题研究计划基金(T12-703/22-R 和 T12-703/23-N)资助。
贝锦新课题组主要从事精准医学和转化医学研究,围绕肿瘤精准医学的核心理念,利用个体和单细胞水平的基因组、表达谱等多层次、多组学信息,挖掘与肿瘤发生发展及其异质性相关的分子、细胞及其作用网络,研究候选分子、细胞调控肿瘤进展的重要机制,发现与肿瘤早期精准诊断相关的分子标志物,筛选针对肿瘤微环境演进关键事件的精准诊治靶标,为实现肿瘤的个体化防诊治提供有效解决方案。至今发表SCI论文100余篇,其中包括国际顶级专业杂志Cell、Lancet Oncology、Nature Genetics、Advanced Science、Genome Biology、Nature Communications等。团队拥有高通量测序及基因分型、单细胞组学平台(10X Genomics联合实验室)、高性能计算集群等平台,所在依托单位拥有先进的动物、细胞、分子水平相关研究平台。课题组经费充足、科研氛围浓厚、团队成员关系融洽。课题组长期招聘各类科研人员,欢迎对相关领域感兴趣的博士后,博士生加入。
论文详情请查阅:https://doi.org/10.1038/s41467-024-52153-4